近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應(yīng)用已進(jìn)展至臨床檢測，如遺傳疾病、實(shí)體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細(xì)胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。想完成這一系列檢測分析肯定離不開一間功能完備的實(shí)驗(yàn)室，那么，關(guān)于二代測序?qū)嶒?yàn)室裝修都應(yīng)注意什么？

實(shí)驗(yàn)室總體要求

NGS檢測實(shí)驗(yàn)室的總體設(shè)計與要求應(yīng)參考《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室建設(shè)指南（試行）》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》、《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》、《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南》、《個體化醫(yī)學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室管理辦法》、《測序技術(shù)的個體化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)指南（試行）》進(jìn)行。

1、NGS檢測人員的資質(zhì)要求：NGS檢測技術(shù)人員應(yīng)具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷，并經(jīng)過NGS技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)合格。數(shù)據(jù)分析人員應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓(xùn)。最終報告應(yīng)由中級或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓(xùn)合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權(quán)簽字人(醫(yī)學(xué)博士學(xué)位或高級職稱)審核。

2、NGS檢測實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域設(shè)置要求：原則上NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)有以下分區(qū)：樣本前處理區(qū)、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域（第一擴(kuò)增區(qū)）、文庫擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）、文庫檢測與質(zhì)控區(qū)、測序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》。分區(qū)可根據(jù)實(shí)際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應(yīng)與組織樣本分開。

3、NGS檢測試劑及項(xiàng)目要求：試劑和測序平臺均應(yīng)選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)認(rèn)可產(chǎn)品。涉及到實(shí)驗(yàn)室自配試劑，應(yīng)該有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目(LDT)驗(yàn)證合格才可使用。每個NGS檢測項(xiàng)目在驗(yàn)證時需要根據(jù)建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數(shù)變異Copynumber variations（CNVs）、染色體結(jié)構(gòu)變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的準(zhǔn)確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進(jìn)行LDT驗(yàn)證。應(yīng)該有經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品測試的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測序深度。經(jīng)驗(yàn)證后，SOP發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項(xiàng)目等都需要重新做驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果簽名留底備案。

4、NGS檢測實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理要求：NGS檢測主要包括實(shí)驗(yàn)操作和生物信息

學(xué)分析兩部分。實(shí)驗(yàn)操作部分包括樣本準(zhǔn)備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標(biāo)區(qū)域富集、測序等；生物信息學(xué)分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系文件和SOP及機(jī)器運(yùn)行和維護(hù)SOP，具有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評以有及持續(xù)的質(zhì)量保證和改進(jìn)計劃。

NGS分析樣本、基因panel和轉(zhuǎn)運(yùn)要求

NGS分析樣本類型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊石蠟包埋標(biāo)本和血漿/血液標(biāo)本等。

對于腫瘤體細(xì)胞變異初次NGS檢測應(yīng)首選經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的再次檢測可選取液體樣本動態(tài)監(jiān)測。

NGS檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測序。

不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機(jī)構(gòu)的專家共同決定，已達(dá)到不同實(shí)驗(yàn)室之間的可比性和完善性。

未經(jīng)病理評估的基因檢測結(jié)果不可單獨(dú)用于分子病理臨床診斷目的。

樣本質(zhì)量對檢測結(jié)果和分析至關(guān)重要，病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進(jìn)一步明確病理診斷，并評價標(biāo)本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCl脫鈣液處理），病變細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議達(dá)到20%以上，低于此標(biāo)準(zhǔn)可富集后檢測。

NGS檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對不同類型的樣本有采集及處理SOP指導(dǎo)。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有不同的樣本運(yùn)送SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運(yùn)輸）應(yīng)有相關(guān)運(yùn)送記錄，確保樣本運(yùn)送安全、無污染、無降解。

NGS檢測流程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1、核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是NGS檢測成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫前應(yīng)采用多種方法對核酸質(zhì)量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應(yīng)的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應(yīng)明確接受和拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

2、文庫制備及其質(zhì)量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應(yīng)對檢測基因、區(qū)域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建立實(shí)驗(yàn)室檢測SOP。建立好文庫后上機(jī)測序前需對文庫進(jìn)行質(zhì)量分析。每個檢測項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

3、NGS測序儀上機(jī)分析及其質(zhì)量分析：NGS建庫主要有擴(kuò)增法和捕獲法兩大策略，測序時根據(jù)檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒?，以保證測序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內(nèi)容、設(shè)定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進(jìn)行測序。產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)要求詳見后文。

4、NGS檢測中的樣本追蹤及對照設(shè)置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點(diǎn)或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識（sample ID），在檢測前對每個樣本進(jìn)行SNV位點(diǎn)信息的測定，在NGS檢測后對上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒有交叉污染。（2）陽性對照：應(yīng)用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)時同時檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進(jìn)行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。（4）應(yīng)對方案和替代方法：各個質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異常或失敗，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有應(yīng)對措施或備選方案；對于測序結(jié)果質(zhì)量差或有問題的區(qū)域應(yīng)建立替代方法（如Sanger測序）。

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